772.反向输出(2/3)
。为了表征RAS靶向对MAF功能的影响，我们在用氯沙坦（一种AT1阻滞剂）或卡托普利（一种ACE抑制剂）治疗后进行了凝胶收缩试验。在低浓度（氯沙坦为1，卡托普利为5）和高浓度（氯沙坦为10，卡托普利为50）时，两者都显着降低了MAF凝胶收缩（图PR）。
5、RAS抑制降低转移基质硬度并重塑微环境与无高血压组和非RAS治疗组2相比，接受抗RAS药物治疗的患者组织硬度显着降低（图AB）。进一步评估（通过对同一患者组中的COL1、aSMA和pMLC2染色）是否可以通过MAF激活的下调来解释转移刚度的差异。虽然高血压与pMLC2染色的增加相关，但我们没有观察到对aSMA和COLI的影响（图CH）。在所有组中，抗RAS治疗显示MAF激活和ECM沉积显着减少（图CH）。抗RAS药物的作用独立于特定的RAS抑制治疗。观察到转移僵硬（不同条件±高血压±抗RAS药物）与COLI、aSMA和pMLC2表达之间呈正相关（图IK），表明MAF激活水平有助于组织僵硬在LM。总之，接受抗RAS治疗的患者显示出低肌成纤维细胞/ECM特征，这解释了转移硬化的减少。
6、AT1R信号转导通过RhoA介导MAF激活接下来，作者想确定RAS抑制如何导致MAF激活减少。体外用氯沙坦或卡托普利处理MAF表明LOX和COL1A1NA表达降低（图AB）。pMLC2在RAS抑制后也显着减少（图CD）。氯沙坦和卡托普利治疗显着降低了ARHGEF1的酪氨酸磷酸化，并导致活性RhoA减少（图EH）。类似地，ARHGEF1的敲低导致pMLC2减少，支持血管紧张素ARHGEF1RhoA轴在MAF中的作用（图IJ）。总的来说，我们结果表明RAS通路抑制剂通过抑制MAF主动收缩（图K）以及减少胶原蛋白生成和交联来阻止基质硬化，从而改善肿瘤纤维化过程。
7、RAS抑制增加了贝伐单抗的抗血管生成作用基质硬度不受单独贝伐单抗治疗的影响（图AB）。在Bev组中，与非RAS治疗的高血压患者和无高血压患者相比，抗RAS治疗导致组织硬度降低（图A，C）。类似地，在Bev组中，在抗RAS治疗的患者中也观察到了相同的基质硬度降低（所有p＜0.001）（图A，D）。此外，抗RAS治疗组的硬度降低与特定治疗无关。单独的贝伐单抗治疗不影响LM内的COLI、aSMA和pMLC2。为了评估抗血管生成治疗（贝伐珠单抗治疗）和RAS抑制对血管系统的综合影响，我们测量了一大群CRCLM中的血管密度。与Bev组相比，Bev组的血管密度显着降低了48.7±8.2。然而，与非RAS、Bev治疗相比以及与所有Bev组。这与使用的RAS治疗类型无关。因此，抗RAS药物靶向组织硬度，从而影响贝伐单抗的疗效。
8、通过RAS和血管生成抑制减少EC增殖EC增殖随硬度增加而增加，VEGF进一步诱导增殖，低硬度时VEGF效应最高（图AC）。此外，我们分析了在不同密度的纤维蛋白原基质（刚度的代表）中存在或不存在VEGF的情况下EC发芽。EC发芽（芽的数量和长度）随密度增加。VEGF导致在所有条件下进一步发芽，VEGF在软基质中的作用更显着，如EC增殖的情况。
为了了解抗RAS药物和贝伐单抗的组合如何影响转移灶内的EC，我们量化了它们对EC增殖的影响。单独的贝伐单抗治疗导致EC增殖减少56.1±11.0。由于转移僵硬与独立于治疗的转移内的EC增殖相关，我们评估了RAS抑制是否足以减少EC增殖。在未接受抗血管生成治疗的患者中，RAS抑制并未显着降低EC增殖；然而，在接受贝伐单抗和抗RAS药物治疗的患者中，EC增殖进一步降低了78.1±9.2）。
9、RAS和血管生成抑制改善血管完整性有趣的是，VEGF和基质硬化都有效地导致血管通透性。为了进一步表征抗RAS药物对血管完整性的作用，我们通过对紧密连接蛋白ZO1（封闭小带1）进行免疫染色分析了它们对EC连接稳定性的影响。虽然建议贝伐单抗治疗导致消除未成熟血管，但我们观察到贝伐单抗对ZO1紧密连接没有变化（图AB）。与之前在其他疾病模型中的发现一致，即增加基质刚度可增强内皮通透性，我们还观察到ZO1覆盖率与CRCLM的组织硬度之间存在负相关，表明在更硬的LM(图C)。在接受抗RAS药物治疗的Bev患者中，我们还观察到EC中ZO1覆盖率的增加，表明单独的抗RAS足以改善内皮连接稳定性（图A，D）。然而，在联合治疗（Bev和抗RAS）中，对连接稳定性的影响大大增强（图A，E）。
KLF2是一种剪切应力响应转录因子，其表达随层流剪切应力增加，是灌注的标志。抗血管生成治疗没有改变内皮细胞中KLF2的表达（图FG）。然而，KLF2表达与组织刚度呈负相关，表明基质硬度增加会损害灌注（图H）。在未接受贝伐珠单抗治疗的患者中，KLF2表达未因抗RAS治疗而改变（图FI），但在抗
5、RAS抑制降低转移基质硬度并重塑微环境与无高血压组和非RAS治疗组2相比，接受抗RAS药物治疗的患者组织硬度显着降低（图AB）。进一步评估（通过对同一患者组中的COL1、aSMA和pMLC2染色）是否可以通过MAF激活的下调来解释转移刚度的差异。虽然高血压与pMLC2染色的增加相关，但我们没有观察到对aSMA和COLI的影响（图CH）。在所有组中，抗RAS治疗显示MAF激活和ECM沉积显着减少（图CH）。抗RAS药物的作用独立于特定的RAS抑制治疗。观察到转移僵硬（不同条件±高血压±抗RAS药物）与COLI、aSMA和pMLC2表达之间呈正相关（图IK），表明MAF激活水平有助于组织僵硬在LM。总之，接受抗RAS治疗的患者显示出低肌成纤维细胞/ECM特征，这解释了转移硬化的减少。
6、AT1R信号转导通过RhoA介导MAF激活接下来，作者想确定RAS抑制如何导致MAF激活减少。体外用氯沙坦或卡托普利处理MAF表明LOX和COL1A1NA表达降低（图AB）。pMLC2在RAS抑制后也显着减少（图CD）。氯沙坦和卡托普利治疗显着降低了ARHGEF1的酪氨酸磷酸化，并导致活性RhoA减少（图EH）。类似地，ARHGEF1的敲低导致pMLC2减少，支持血管紧张素ARHGEF1RhoA轴在MAF中的作用（图IJ）。总的来说，我们结果表明RAS通路抑制剂通过抑制MAF主动收缩（图K）以及减少胶原蛋白生成和交联来阻止基质硬化，从而改善肿瘤纤维化过程。
7、RAS抑制增加了贝伐单抗的抗血管生成作用基质硬度不受单独贝伐单抗治疗的影响（图AB）。在Bev组中，与非RAS治疗的高血压患者和无高血压患者相比，抗RAS治疗导致组织硬度降低（图A，C）。类似地，在Bev组中，在抗RAS治疗的患者中也观察到了相同的基质硬度降低（所有p＜0.001）（图A，D）。此外，抗RAS治疗组的硬度降低与特定治疗无关。单独的贝伐单抗治疗不影响LM内的COLI、aSMA和pMLC2。为了评估抗血管生成治疗（贝伐珠单抗治疗）和RAS抑制对血管系统的综合影响，我们测量了一大群CRCLM中的血管密度。与Bev组相比，Bev组的血管密度显着降低了48.7±8.2。然而，与非RAS、Bev治疗相比以及与所有Bev组。这与使用的RAS治疗类型无关。因此，抗RAS药物靶向组织硬度，从而影响贝伐单抗的疗效。
8、通过RAS和血管生成抑制减少EC增殖EC增殖随硬度增加而增加，VEGF进一步诱导增殖，低硬度时VEGF效应最高（图AC）。此外，我们分析了在不同密度的纤维蛋白原基质（刚度的代表）中存在或不存在VEGF的情况下EC发芽。EC发芽（芽的数量和长度）随密度增加。VEGF导致在所有条件下进一步发芽，VEGF在软基质中的作用更显着，如EC增殖的情况。
为了了解抗RAS药物和贝伐单抗的组合如何影响转移灶内的EC，我们量化了它们对EC增殖的影响。单独的贝伐单抗治疗导致EC增殖减少56.1±11.0。由于转移僵硬与独立于治疗的转移内的EC增殖相关，我们评估了RAS抑制是否足以减少EC增殖。在未接受抗血管生成治疗的患者中，RAS抑制并未显着降低EC增殖；然而，在接受贝伐单抗和抗RAS药物治疗的患者中，EC增殖进一步降低了78.1±9.2）。
9、RAS和血管生成抑制改善血管完整性有趣的是，VEGF和基质硬化都有效地导致血管通透性。为了进一步表征抗RAS药物对血管完整性的作用，我们通过对紧密连接蛋白ZO1（封闭小带1）进行免疫染色分析了它们对EC连接稳定性的影响。虽然建议贝伐单抗治疗导致消除未成熟血管，但我们观察到贝伐单抗对ZO1紧密连接没有变化（图AB）。与之前在其他疾病模型中的发现一致，即增加基质刚度可增强内皮通透性，我们还观察到ZO1覆盖率与CRCLM的组织硬度之间存在负相关，表明在更硬的LM(图C)。在接受抗RAS药物治疗的Bev患者中，我们还观察到EC中ZO1覆盖率的增加，表明单独的抗RAS足以改善内皮连接稳定性（图A，D）。然而，在联合治疗（Bev和抗RAS）中，对连接稳定性的影响大大增强（图A，E）。
KLF2是一种剪切应力响应转录因子，其表达随层流剪切应力增加，是灌注的标志。抗血管生成治疗没有改变内皮细胞中KLF2的表达（图FG）。然而，KLF2表达与组织刚度呈负相关，表明基质硬度增加会损害灌注（图H）。在未接受贝伐珠单抗治疗的患者中，KLF2表达未因抗RAS治疗而改变（图FI），但在抗
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